II. KAJIAN PUSTAKA

Bab ini membahas mengenai : 1) Cookies, 2) Tepung Campuran (Komposit), 3) Protein,  4)  Zat Besi, 5) Berat Badan, 6) Kadar Hemoglobin, 7) Wanita Usia Subur (WUS) dan 8) Tikus Galur Sprague Dawley.
2.1. Cookies 
Cookies atau kue kering adalah produk baking yang mempunyai bentuk kecil dan mempunyai tekstur renyah, biasanya dibuat dari adonan yang manis dengan variasi isi dan topping (Herudiyanto, 2009). Biskuit dapat dikelompokkan menjadi krekers, cookies, wafer dan pai. Cookies merupakan jenis biskuit yang dibuat dari adonan lunak, berkadar lemak tinggi, renyah dan apabila dipatahkan penampangannya bertekstur kurang padat (SNI, 2011). Proses pembuatan dan bahan yang digunakan cookies tidak jauh berbeda dengan cake; yang membedakan yaitu ukuran dan tingkat kekeringannya. 

10

Cookies yang baik memiliki beberapa karakteristik jika dilihat dari warna, tektur, rasa, aroma dan bahan yang digunakan tidak mengandung bahan cemaran logam maupun mikroba yang melebihi batas yang ditentukan oleh Departemen Perindustrian RI (1990). Berdasarkan warnanya, cookies yang umum dibuat dari terigu memiliki warna kuning kecoklatan bila telah matang, tekstur biasanya beremah, sedangkan untuk rasa dan aroma tidak boleh menyimpang dari bahan pembuatnya. Definisi menurut Departemen Perindustrian (1992) cookies dimasukkan dalam golongan biskuit, yaitu dibuat dari adonan jenis lunak berkadar lemak tinggi, renyah dan bila dipatahkan penampang potongannya bertekstur kurang padat. Cookies disukai oleh seluruh kalangan usia karena rasanya yang enak, bervarasi, bentuk beraneka garam, harga relatif murah, cukup mengenyangkan, hingga kandungan gizi yang lengkap. Cookies mudah dibawa dan umur simpannya yang relatif lama.
2.1.1 Bahan - Bahan Pembuatan Cookies
Bahan - bahan yang diperlukan dalam pembuatan cookies dibagi menjadi dua kelompok, yaitu bahan pengikat dan bahan pelembut (Soegiharto, 1995). Bahan pengikat terdiri dari tepung, air dan telur. Bahan pengikat berfungsi untuk membentuk adonan yang bersifat kompak, sedangkan bahan pelembut terdiri dari gula, shortening/lemak, baking powder, dan kuning telur. Tepung, telur dan baking powder merupakan komponen yang berperan dan berpengaruh terhadap sifat - sifat cookies, khususnya sifat fisik dan cita rasa (Matz, 1992). 	
1)	Tepung
Tepung terigu merupakan bahan dasar yang berpengaruh terhadap pembentukan struktur dan pengikat serta cita rasa dari cookies berfungsi untuk membentuk adonan yang stabil, membentuk struktur, mengikat bahan-bahan lain dan mendistribusikan bahan-bahan secara merata. Terigu yang bersatu dengan telur akan memberikan struktur pada produk cookies (Matz and Matz, 1978). Tepung terigu memiliki karakteristik yang berbeda dibandingkan dengan tepung yang lain. Tepung terigu dengan kadar protein 7,0 - 9,0%, dengan butiran yang halus sangat cocok untuk membuat kue kering. 
Tepung yang biasa digunakan dalam pembuatan cookies ini adalah tepung gandum lunak yang mempunyai protein rendah yaitu 8,0 - 9,0% (Sutomo, 2006). Penelitian ini menggunakan tepung komposit kacang merah dan kacang hijau sebagai bahan dasar pembuatan cookies pengganti tepung terigu. Tepung terigu mengandung zat besi 1,3 mg dan protein 9,0 gram per 100 gram, lebih rendah dibandingkan dengan kandungan zat besi dan protein tepung komposit kacang merah dan kacang hijau. Kacang hijau mengandung zat besi 7,4 mg dan protein sebesar 22,9 gram dan kacang merah mengandung zat besi 6,8 mg dan protein sebesar 13,9 gram per 100 gram. Sehingga diharapkan dengan mengganti tepung terigu dengan tepung komposit kacang merah dan kacang hijau dapat membuat kandungan zat besi dan protein lebih besar dibandingkan dengan cookies berbahan dasar tepung terigu.
2)	Gula
Gula berpengaruh terhadap  penyebaran adonan cookies. Gula yang digunakan dapat berbentuk gula pasir, gula pasir halus dan gula tepung. Gula pasir menyebabkan cookies menyebar secara maksimum selama pembakaran berlangsung dan sebagian besar tetap sebagai butiran - butiran gula, sehingga cookies yang dihasilkan mempunyai kenampakan yang merekah atau pecah-pecah. Bila cookies ini dimasukkan ke dalam oven panas, kristal - kristal gula akan meleleh dan menyebabkan reaksi yang menyebar. Gula halus merupakan gula yang paling baik untuk pembuatan kue kering karena tidak menyebabkan terlalu besarnya penyebaran kue kering (Desroiser, 1988). 
Penelitian ini menggunakan gula pasir dan gula palm. Gula pasir berasal dari cairan sari tebu. Setelah dikristalkan, sari tebu akan mengalami kristalisasi dan berubah menjadi butiran gula berwarna putih bersih atau putih agak kecoklatan (raw sugar). Sedangkan gula palm atau brown sugar terbuat dari tetes tebu, namun dalam proses pembuatannya dicampur dengan molase sehingga menghasilkan gula bewarna kecoklatan. Terbagi menjadi 2 jenis yaitu light atau dark brown sugar. Light brown sugar biasanya digunakan dalam pembuatan kue, seperti membuat butterscotch, kondimen 13 dan glazes. Dark brown sugar biasanya digunakan untuk membuat gingerbread dan bahan tambahan untuk makanan seperti mincemeat, baked bean dan lain - lain (Darwin, 2013).
3)	Lemak
Lemak merupakan bahan baku yang sangat penting dalam pembuatan cookies. Selama pengadukan suatu adonan, lemak akan mengelilingi terigu sehingga jaringan gluten didalamnya diputus dan setelah menjadi cookies tekturnya akan lebih lembut dan tidak terlalu keras (Hanafi, 1999). Lemak yang dapat digunakan adalah mentega, minyak tumbuhan, margarin atau lemak hewan. Jenis dan jumlah lemak pada cookies akan memengaruhi adonan selama pembentukan dan menentukan kualitas produk akhir. Jenis lemak juga akan memengaruhi penyebaran dan penampakan cookies (Matz and Matz,1978). 
Mentega mempunyai sifat organoleptik yang baik, tekstur plastis dan stabil, aroma menyenangkan, bebas asam dan tidak berminyak. Lemak padat dan lemak plastis berfungsi untuk memperbaiki cita rasa, membentuk tekstur, memperbaiki tekstur, meningkatkan keempukan dan volume. Substitusi minyak dengan lemak akan meningkatkan volume spesifik, memperbaiki kekerasan dan kualitas makanan. Margarin merupakan bahan berlemak yang telah ditambah pewarna, flavor, garam serta vitamin A dan D. Dalam pembuatan cookies digunakan margarin karena kemampuannya melembutkan butiran kue dan daya pengkrimannya yang baik.
4)	Telur
	Penggunaan telur akan mempengaruhi tekstur cookies, karena sifat telur sebagai pengemulsi, pengaerasi, pelembut dan pengikat. Telur berfungsi untuk meningkatkan nilai gizi, memberikan warna dan flavor yang disukai. Penggunaan kuning telur untuk menggantikan sebagian atau seluruh telur akan menghasilkan cookies yang lembut (Matz and Matz, 1978).
5)	Baking Powder
Baking powder merupakan bahan peragi kimia yang terbuat hasil reaksi asam dengan natrium bikarbonat, dengan atau tanpa penambahan pati atau tepung (Sultan, 1986). Baking powder merupakan campuran natrium bikarbonat dengan pereaksi asam, dengan atau tanpa penambahan pati. Pereaksi asam yang digunakan yaitu garam asam dari asam tartrat, asam fosfat atau komponen alumunium (Matz,1992). Adanya baking powder dalam pembuatan cookies sangat membantu dalam peningkatan volume dan terbentuknya keremahan. Selama proses pemanggangan gula akan terkaramelisasi, adanya panas dan asam dari baking powder akan menghasilkan CO2 yang mengembangkan cairan karamel dalam adonan sehingga cookies beremah.
6)	Garam 
Garam yang ada pada adonan cookies ditambahkan dalam jumlah sedikit, biasanya juga menggunakan garam ≤1,0%. Jumlah dan jenis mineral yang terlarut dan zat organik dalam adonan akan memengaruhi terbentuknya flavor dan sifat fisik cookies (Matz and Matz, 1978). Garam berfungsi mencegah terjadinya karamelisasi pada adonan dan membantu memperoleh warna yang baik (U.S. Wheat Association, 1983).
7)	Coklat
	Biji coklat diperoleh dari buah tanaman coklat (Theobroma cacao). Berdasarkan bentuk dari buahnya, coklat dibedakan menjadi jenis kriolo yang bentuknya agak memanjang dan jenis  forastero yang memiliki bentuk agak bulat. Biji coklat mentah yang masih segar terdiri dari bagian pulp, kulit biji, kulit air, keeping biji dan lembaga (Muchtadi. T, Sugiyono, Ayustaningwarno. F, 2015). Tanaman kakao (Theobroma cacao L) merupakan tanaman yang digunakan sebagai penyedap makanan juga sebagai sumber lemak nabati. Kakao ini juga digunakan sebagai bahan dalam pembuatan minuman, campuran gula-gula atau jenis makanan lainnya (Siregar dan Riyadi, 1994).
Coklat juga mengandung zat maupun nutrisi yang penting untuk tubuh seperti zat besi, kalium dan kalsium, dan sebagai antioksidan bagi tubuh. Komposisi kandungan zat gizi pada coklat sangat banyak. Biji coklat memiliki kandungan alkanoid yang menyebabkan rasanya menjadi pahit. Protein yang terkandung dalam biji coklat itu memiliki kandungan fenilalanin, tyrosin, asam amino triptofan dalam jumlah besar. 
Tabel 1. Komposisi Kimia Biji Coklat
Komposisi	Kandungan (%)	
Lemak	30 - 35	
Karbohidrat	18	
Protein	18	
Tanin	8 - 10	
Mineral 	3 - 4	
Pigmen	2 - 4	
Asam – asam	0.5 - 1	
Air	Sisanya	
(Sumber : Muchtadi, Sugiyono dan Ayustaningwarno, 2015)
Biji kakao mengandung berbagai macam komponen kimia, zat gizi, dan senyawa bioaktif di dalamnya. Komposisi kimia ini bervariasi setelah mengalami proses pengolahan menjadi produk. Komposisi kimia bubuk kakao berbeda dengan mentega kakao dan pasta coklat. Menurut Tabel Komposisi Pangan (2009) komposisi bubuk coklat per 100 gram adalah mengandung kalori 331,0 kkal; lemak 23,8 gram; karbohidrat 48,9 gram; serat 32,6 gram; protein 8 gram; air 3,9 gram; dan kadar abu 15,4; yang meliputi : kalsium 1,25 mg; besi 11,6mg.
Coklat dengan kandungan kakao (biji coklat) lebih dari 70,0% juga memiliki manfaat untuk kesehatan, karena coklat kaya akan kandungan antioksidan yaitu fenol dan flavonoid yang dapat meningkatkan sistem kekebalan tubuh sangat besar. Antioksidan yang terkandung akan mampu untuk menangkap radikal bebas dalam tubuh. Besarnya kandungan antioksidan ini bahkan 3 kali lebih banyak dari teh hijau, minuman yang selama ini sering dianggap sebagai sumber antioksidan. Kakao juga memiliki banyak manfaat terutama bagi kesehatan karena mengandung fenol, flavonoid, vitamin A, vitamin B1, vitamin C, vitamin D, dan vitamin E. 
Tabel 2. Syarat Mutu Kakao Bubuk
Parameter Uji	Satuan	Syarat Mutu	
Keadaan :	
a.	Bau	-	Khas kakao, bebas dari bau asing	
b.	Rasa	-	Khas kakao, bebas dari bau asing	
c.	Warna	-	Coklat/ warna lain akibat alkalisasi	
Kehalusan (lolos ayakan mesh 200) (b/b)	%	Min. 99,5	
Kulit (shell) dihitung dari alkali free nib (b/b)	%	Maks. 1,75	
Kadar air (b/b)	%	Maks. 5,0	
Kadar lemak (b/b)	%	Min. 10,0	
Cemaran logam:	
a.	Timbal (Pb)	mg/kg	Maks. 2,0	
b.	Kadmium (Cd)	mg/kg	Maks. 1,0	
c.	Timah (Sn)	mg/kg	Maks. 40	
Cemaran arsen (As)	mg/kg	Maks. 1,0	
Cemaran mikroba:	
a.	Angka Lempeng Total	Koloni/g	Maks. 5x103	
b.	Bakteri bentuk coli	APM/g	< 3	
c.	Escherichia coli	per g	Negatif	
d.	Salmonella	per 25 g	Negatif	
e.	Kapang	Koloni/g	Maks. 50	
f.	Khamir	Koloni/g	Maks. 50	
(Sumber: SNI 3747 – 2009)

2.1.2 Formulasi dan Tahapan Pembuatan Cookies
Penentuan optimalisasi formulasi dapat dilakukan dengan berbagai metode antara lain metode simplex dengan pemprograman linier, software lindo, fasilitas solver pada microsoft excel dan design expert metode mixture d-optimal (Tiaraswara, 2016). Penelitian ini menggunakan program linier untuk memaksimalkan kandungan gizi yang sesuai dengan syarat mutu cookies serta meminimalkan harga jual. Program linear merupakan salah satu teknik analisis kuantitatif dari kelompok riset operasi menggunakan model matematika. Persoalan program linier merupakan suatu persoalan untuk menentukan besarnya masing - masing variabel, sehingga nilai fungsi tujuan atau obyektif (objective function) yang linier menjadi optimum dengan memperhatikan pembatasan - pembatasan ini harus dinyatakan dalam ketidaksamaan yang linier (linier inequenalities) (Swanson, 1980). Mencari, memilih, dan menentukan alternatif terbaik diantara sekian alternatif layak yang tersedia adalah tujuan dari penggunaan program linier. Karakteristik - karakteristik dalam program linier yang biasa digunakan untuk memodelkan suatu masalah dan memformulasikannya secara matematik, yaitu (Siswanto, 2006) : 
1)	Variabel Keputusan 
Variabel keputusan adalah variabel yang secara lengkap menguraikan keputusan - keputusan yang akan dibuat. 
2)	Fungsi Tujuan 
Fungsi tujuan merupakan suatu hubungan linier dari variabel keputusan yang berupa fungsi maksimum atau minimum. 
3)	Fungsi Kendala 
Fungsi kendala merupakan batasan - batasan dalam penyelesaian program linier yang harus diperhatikan. Kendala diekspresikan dalam persamaan dan pertidaksamaan yang juga merupakan hubungan linier dari variabel keputusan yang mencerminkan keterbatasan sumber daya dalam suatu masalah.
Menurut Adrizal (2002), pengolahan dengan program linier menggunakan aplikasi komputer dapat menghasilkan output berupa formula dan analisis sensitivitas formula yang berguna untuk melihat sejauh mana bahan baku dapat digunakan secara optimal dalam bahan dengan kandungan gizi dan harga yang berlaku. Penggunaan program linier WIN QSB+ dapat menemukan formula yang paling optimum dengan tujuan untuk memaksimalkan atau meminimalkan. Program linier juga dapat digunakan untuk menekan biaya produksi dari suatu produk pangan sehingga dapat menghasilkan keuntungan yang maksimal dengan mutu yang optimal sesuai dengan batas Standar Nasional Indonesia (SNI). 
Faktor pembatas yang digunakan pada pembuatan formulasi cookies, yaitu perbandingan bahan baku tepung komposit dari tepung kacang merah dan kacang hijau, dimana nilai nilai pembatas diambil dari SNI 01-4445-2002 tentang syarat mutu cookies. Selain itu faktor kendala yang dipergunakan adalah harga bahan baku yang digunakan sehingga bisa dihasilkan produk yang berkualitas dengan harga yang terjangkau (Komariah E, 2010). Menurut Supranto (1983), program linier dapat digunakan untuk mengoptimumkan persoalan - persoalan apabila memenuhi persyaratan sebagai berikut :
1)	Fungsi tujuan dapat didefinisikan dengan jelas,
2)	Adanya alternatif atau keputusan yang terdefmisi dengan jelas,
3)	Fungsi tujuan dan fungsi pembatas harus dalam bentuk matematika yang bersifat linier,
4)	Variabel yang satu dengan variabel yang lain hams saling berhubungan secara linier dan tidak negatif,
5)	Sumber - sumber harus dalam kondisi terbatas dan digambarkan dalam set fungsi linier.
Pembuatan cookies memerlukan formula yang tepat sehingga cookies tersebut bisa memiliki karakteristik yang baik. Formulasi cookies menurut metode dari Bakara (1996), yaitu :
Terigu 			: 100 gram
Gula tepung  	  	: 50 gram
Margarin		: 50 gram
Kuning telur		: 15 gram
Baking powder 	: 0,2 gram
Garam 			: 1 gram
Pembuatan cookies meliputi tahap pencampuran yang terdiri dari pembentukan krim dan pembentukan adonan, pencetakan atau pembentukan, pemanggangan, pendinginan dan pengemasan. Menurut Bakara (1996), tahapan dalam pembuatan cookies yaitu :
1)	Pencampuran Bahan
	Pencampuran bahan tahap awal yaitu dengan mencampurkan margarin dan gula tepung agar terbentuknya krim (Herudiyanto, 2009). Saat dilakukan pencampuran gula dan mentega tidak boleh dikrimkan terlalu lama sebab dapat menyusutkan ukuran kristal gula (Kartohadiprodjo dkk, 2000).
2)	Pengocokan  dan pengadukan adonan 
		Proses setelah gula tepung dan margarin dicampur yaitu pengocokan. Pengocokan yang pertama yaitu komposit gula tepung dan margarin ditambahkan kuning telur, garam, dan baking powder. Menurut Hanafi (1999), agar semua bahan menyebar secara rata maka margarin, gula tepung, telur, garam dan baking powder dibuat krim terlebih dahulu. Proses pengocokan tidak terlalu lama karena dapat mengakibatkan adonan yang dibuat menjadi lembek. Pengocokan yang terlalu berlebihan juga akan menyebabkan cookies menjadi padat dan keras sebagai hasil dari penambahan udara terlalu banyak (Herudiyanto, 2009). Pengadukan adonan dapat dilakukan setelah penkomposit krim, yaitu dengan memasukkan tepung pada krim lalu pengadukan adonan dengan menggunakan sendok kayu agar menjadi satu adonan yang homogen.
3)	Pencetakan adonan
	Pencetakan dilakukan dilakukan agar diperoleh produk dengan bentuk yang seragam dengan berbagai cara yaitu disemprot, dicetak dengan tangan dan ditipiskan terlebih dahulu baru dicetak dengan menggunakan cetakan kue. Menurut Katohadiprodjo dkk (2000) penempatan diatas loyang diusahakan agar jarak antara cookies yang satu dengan yang lain cukup jauh, untuk menghindari saling menempel selama pemanggangan berlangsung sehingga cookies yang dihasilkan tidak lengket. 
4)	Pemanggangan
	Pemanggangan dilakukan dalam oven bersuhu antara 1800C sampai 2000C dalam waktu selama 10 sampai 20 menit sampai warna cookies menjadi kuning kecoklatan. Oven tidak boleh terlalu panas saat cookies dimasukkan karena bagian luarnya akan cepat matang dan bagian dalam masih mentah, hal ini akan menghambat pengembangan dan permukaan cookies, sehingga permukaan cookies menjadi pecah. Menurut Wardani (2003), saat proses pemanggangan terjadi beberapa reaksi dengan kecepatan yang berbeda antara lain pengembangan dan perpindahan gas, koagulasi protein telur dan gelatinisasi pati, pengembangan cita rasa (flavor), perubahan warna akibat reaksi pencoklatan Maillard, dan pembentukan kulit kue yang agak keras akibat penguapan air pada permukaan.
2.1.3 Karakteristik Cookies
Derajat penerimaan konsumen terhadap mutu cookies sangat dipengaruhi oleh sifat kimia, fisika, dan organoleptik dari produk yang dihasilkan (Wardani, 2003). Sifat kimia cookies ditentukan oleh bahan dasar yang digunakan terutama kadar protein yang terdapat dalam adonan. Sifat fisik cookies ditentukan oleh bahan pembentuk cookies terutama lemak dan gluten (terigu) yang akan memengaruhi pembentukan tekstur dan sifat penyebaran dari cookies yang dihasilkan. Umumnya cookies dianggap baik bila mempunyai bentuk seragam, teksturnya renyah, warnanya kuning keemasan dan mempunyai flavor yang spesifik sesuai dengan jenis produk, serta memenuhi syarat mutu cookies yang ditetapkan oleh Standar Nasional Indonesia dapat dilihat pada Tabel 3. 

Tabel 3. Syarat Mutu Cookies Menurut (SNI No. 01-2973-1992)
No	Kriteria Uji	Persyaratan	
1.	Keadaan :
a.	Bau
b.	Rasa
c.	Warna
d.	Tekstur	
Normal
Normal
Normal
Normal	
2.	Air (%b/b)	Maksimum 5	
3.	Protein (%b/b)	Minimum 6	
4.	Abu (%b/b)	Maksimum 2	
5.	Lemak (%b/b)	Minimum 9,5*	
6.	Karbohidrat (%b/b)	Minimum 70*	
7.	Nilai Kalori (kkal)	Minimum 400*	
5.	Bahan Tambahan Makanan
a.	Pewarna 
b.	Pemanis buatan	
Yang diizinkan
Tidak boleh ada	
6.	Cemaran logam :
a.	Tembaga (mg/kg)
b.	Timbal (mg/kg)
c.	Seng (mg/kg)
d.	Mercury (mg/kg)	
Maksimum 1.0
Maksimum 4.0
Maksimum 0.05
Maksimum 0.5	
7.	Arsen (mg/kg)	Maksimum 0.5	
8.	Cemaran Mikroba :
a.	Angka lempeng total (koloni/g)
b.	Coliform (APM/g)
c.	E. Coli
d.	Kapang (koloni/g)	
Maksimum 1 x 106
Maksimum 20
Kurang dari 3
Maksimum 10	
(Sumber : Dewan Standardisasi Nasional, 1992
   	   * Departemen Perindustrian RI, 1990)
Berikut ini beberapa contoh penyimpangan yang terjadi dalam pembuatan cookies dapat dilihat di Tabel 4.
Tabel 4. Jenis Penyimpangan Cookies
Jenis Penyimpangan	Penyebab	
Keras	Kurang lemak, kurang air	
Warna pucat	Proporsi bahan kurang tepat, oven kurang panas	
Bentuk tidak rata	Pencampuran tidak rata, penanganan tidak hati-hati, panas tidak rata	
Warna tidak rata	Panas tidak rata, proporsi bahan pembentuk tidak seimbang	
Hambar	Pencampuran tidak tepat	
Keras, poros, kering	Adonan terlalu keras dan kenyal, penanganan terlalu lama	
(Sumber : U. S. Wheat Association, 1983)
Berdasarkan Peraturan Kepala Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia tentang pengawasann klaim dalam label dan iklan pangan olahan. Syarat menjadi cookies sumber zat besi adalah sebagai berikut:
Tabel 5. Klaim Kandungan Zat Gizi “Sumber” atau “Tinggi”
Komponen	Klaim	Persyaratan Tidak Kurang dari	
Vitamin dan Mineral	Sumber	15% ALG per 100 g (dalam bentuk padat)
atau
7,5% ALG per 100 g (dalam bentuk cair)	
	Tinggi	2 kali jumlah untuk “sumber”	
(Sumber : Peraturan Kepala Badan Pengawasan Obat dan Makanan Republik Indonesia nomor HK.03.1.23.11.11.09909 Tahun 2011 tentang pengawasan klaim dalam label dan iklan pangan olahan)
Cookies merupakan makanan ringan yang dapat dinikmati setiap saat juga dapat mensuplai energi yang cukup baik untuk menjalankan aktivitas sehari - hari. Kontribusi cookies terhadap kebutuhan kecukupan energi adalah 35,0%, 0,8% protein, 1,1% lemak dan 5,4% karbohidrat. Cookies juga cukup potensial untuk terus dikembangkan sebagai makanan ringan yang menyehatkan. 
2.1.4 Pengujian Organoleptik Cookies
Hal - hal yang menentukan terhadap daya terima suatu makanan adalah sifat organoleptik yang dinilai dengan uji organoleptik. Ayustaningwarno (2014) menyebutkan pengujian organoleptik disebut sebagai penilaian indera atau penilaian sensorik yang merupakan suatu cara penilaian dengan memanfaatkan panca indera manusia untuk mengamati tekstur, warna, bentuk, aroma, rasa suatu produk makanan, minuman atau obat. Sifat - sifat organoleptik yang diamati dalam penelitian ini antara lain yaitu :
1)	Aroma
Aroma atau bau dapat menentukan enak atau tidaknya suatu makanan. Bagi industri makanan penilaian menggunakan uji bau ini sangat penting karena dengan cepat memberikan hasil penilaian terhadap suatu produk yang disukai atau tidak.  
2)	Rasa 
 Rasa merupakan hasil respon indra perasa yaitu lidah. Shewfelt (2011) menambahkan bahwa cita rasa adalah persepsi terhadap senyawa spesifik di lidah. Indra perasa sangat berguna untuk menilai kesukaan konsumen terhadap suatu produk. 

3)	Warna
Warna merupakan respon dari mata manusia terhadap rangsangan sinar, melalui warna uji organoleptik dapat dilakukan dengan cepat karena warna memberi kesan langsung yang dapat dilihat oleh indra kita. Indra ini digunakan untuk menilai apakah warna produk sesuai atau tidak dengan warna yang diinginkan. Warna yang dapat kita lihat dari suatu produk makanan merupakan hasil dari pigmen alami dalam makanan atau karena adanya penambahan pewarna alami atau sintetis (Shewfelt, 2011).
4)	Tekstur
Tekstur merupakan karakteristik yang dapat dinilai dengan memakai indra peraba ujung jari (sensasi sentuhan) yang mempunyai kepekaan istimewa dan sangat berguna untuk menilai suatu produk hasil komoditi. Penilaian organoleptik terdiri dari enam tahapan yaitu menerima produk, mengenali produk, mengadakan klarifikasi sifat - sifat produk, mengingat kembali produk yang telah diamati, dan menguraikan kembali sifat inderawi produk. Kelemahan dan keterbatasan uji organoleptik diakibatkan oleh beberapa sifat inderawi yang tidak dapat dideskripsikan. Manusia yang dijadikan panelis bisa mengalami kejenuhan dan penurunan kepekaan. Selain itu bisa terjadi salah komunikasi antara manajer dan panelis (Meilgaard, 1991). 
Berdasarkan tingkat sensitifitas dan tujuan dari setiap pengajian dikenal beberapa macam panelis antara lain panelis perorangan, panelis perseorangan terbatas, panelis terlatih, panelis tidak terlatih serta panelis konsumen. Panel tidak terlatih terdiri dari 25 orang awam yang dapat dipilih berdasarkan jenis suku - suku bangsa, tingkat sosial dan pendidikan. Panel tidak terlatih hanya diperbolehkan menilai alat organoleptik yang sederhana. Penelitian ini menggunakan panelis tidak terlatih untuk uji organoleptik cookies dengan jumlah sebanyak 50 orang yang melebihi ketentuan menurut BSN (2006). Selanjutnya, syarat – syarat panelis adalah tertarik terhadap uji sensori, konsisten dalam mengambil keputusan, berbadan sehat, bebas dari penyakit THT, tidak buta warna serta gangguan psikologis, tidak menolak makanan yang akan diuji (tidak alergi), tidak melakukan uji 1 jam sebelum makan dan menunggu minimal 20 menit setelah merokok, makan permen karet, makanan dan minuman ringan.
2.2. Tepung Campuran (Komposit)
Tepung campuran merupakan suatu makanan campuran beberapa makanan dalam perbandingan tertentu, agar diperoleh suatu produk dengan nilai gizi tinggi. Prinsip dalam pembuatan tepung campuran adalah bernilai gizi tinggi (terutama energi dan protein), cita rasa yang dapat diterima dan dibuat dari bahan makanan setempat. Tepung campuran yang telah diproduksi dan diteliti pada umumnya dibuat dalam bentuk bubuk/ tepung, yang ditunjukan sebagai makanan yang dapat melengkapi nilai gizi sehari - hari (Komariah E, 2010). Salah satu cara untuk meningkatkan kualitas sumber daya manusia adalah rnelalui peningkatan mutu makanan yang dikonsumsi. Upaya yang dapat dilakukan adalah penyediaan bahan makanan yang berasal dari bahan serealia sebagai sumber karbohidrat dan kacang - kacangan sumber protein nabati serta ikan sumber protein hewani. Pencarian dan penggunaan bahan mentah yang terdapat di daerah setempat dan harganya terjangkau, tetapi kaya akan gizi, merupakan alternatif yang terbaik. 
Tepung campuran adalah campuran beberapa bahan makanan dalam perbandingan tertentu, yang mempunyai nilai gizinya tinggi. Tepung campuran merupakan salah satu bentuk bahan hasil proses suplementasi dengan menggunakan beberapa jenis bahan makanan untuk saling melengkapi dalam hal kandungan gizi. Prinsip dalam pembuatan tepung campuran adalah bernilai gizi tinggi (terutama energi dan protein), dapat diterima cita rasanya dan dibuat dari bahan makanan setempat. Salah satu kegunaan tepung campuran adalah sebagai makanan tambahan untuk golongan rawan gizi atau bagi orang - orang yang tidak dapat mencukupi kebuthan tubuhnya akan zat gizi dari hidangan sehari - hari. 
Tepung campuran dapat dijadikan salah satu alternatif untuk memenuhi asupan zat gizi terutama energi dan protein bagi anak balita. Tepung campuran yang telah diproduksi dan diteliti pada umumnya dibuat dalam bentuk bubuk/ tepung cookies dan biskuit, ditujukan sebagai makanan yang dapat melengkapi nilai gizi makanan masyarakat. Konsumsi tepung campuran yang disarankan sekitar 100 gram berat kering. Produk ini tidak disarankan untuk bayi berusia dibawah enam bulan, kecuali bahan tersebut telah secara khusus mendapat perlakuan sehingga dapat dicerna dengan sempurna. Penggunaan tepung campuran dapat membantu memenuhi kebutuhan protein. Penyajian makanan campuran diharapkan kekurangan zat gizi pada satu jenis pangan dapat ditutupi dari penggunaan bahan pangan lainnya (Winarno, 1995). Jika hanya menggunakan satu jenis pangan dikhawatirkan kebutuhan gizi akan sulit dipenuhi.
2.2.1 Tepung Kacang Hijau
Kacang hijau adalah sejenis tanaman budidaya dan palawija yang dikenal luas di daerah tropika. Tumbuhan yang termasuk suku polong - polongan (Fabaceae) ini memiliki banyak manfaat dalam kehidupan sehari - hari sebagai sumber bahan pangan berprotein nabati tinggi. Kacang hijau di Indonesia menempati urutan ketiga terpenting sebagai tanaman pangan legum, setelah kedelai dan kacang tanah. Menurut Purwono (2012), alam dunia tumbuhan tanaman ini diklasifikasikan sebagai berikut :
Divisi 		: Spermatophyta
Sub divisi 	: Angiospermae
Kelas 		: Dicotyledone
Ordo 		: Rosales
Family		 : Leguminosae (Fabaceae)
Genus		 : Vigna
Spesies 	: Vigna radiate atau Phaseolus radiates
Tabel 6. Komposisi Zat Gizi per 100 gram Kacang Hijau
Zat Gizi	Kadar per 100 Gram	
Air (g)	15,5	
Energi (kkal)	323	
Protein (g)	22,9	
Lemak (g)	1,5	
KH (g)	56,8	
Besi (mg)	7,5	
As. Folat (µg)	121	
(Sumber : Tabel Komposisi Pangan 2009)
Keunggulan kacang hijau dibandingkan kacang-kacangan lainnya yaitu : umur tanamnya singkat (55 - 65 hari), dapat bertahan pada cuaca kering, dapat ditanam pada lahan yang kurang subur sebagai penyubur tanah, mampu bersimbiosis dengan rhizobium dan menghasilkan banyak biomasa (11 - 12 t/ha). Selain itu, cara budidaya kacang hijau mudah dan harga jual lebih tinggi dari harga kedelai, namun lebih rendah dari harga kacang tanah. Keunggulan tersebut menjadikan kacang hijau sebagai komoditas alternatif untuk dikembangkan dilahan kering  (Kasno, 2007). Kacang hijau mengandung protein yang sifatnya mirip dengan terigu, yaitu prolamin dan glutelin. Protein kacang hijau kaya akan asam amino esensial seperti leusin, isoleusin, fenilalanin, valin, dan lisin dan dikatakan memiliki protein bermutu baik untuk tubuh manusia (Winarno, 2007). Sebelum dibuat menjadi cookies, kacang hijau dijadikan tepung terlebih dahulu. Kacang hijau dapat dibuat tepung kacang hijau, tepung hunkwe, sari kacang hijau. Berikut ini syarat mutu standar tepung kacang hijau yang dapat dilihat di Tabel 7.
Tabel 7. Syarat Mutu Tepung Kacang Hijau
No.	Kriteria Uji	Satuan	Persyaratan	
1.	Keadaan : Bau, rasa, warna	-	Normal	
2.	Benda asing, serangga dan polong - polongan, jenis pati selain kacang hijau	-	Tidak boleh ada	
3.	Kehalusan:
Lolos ayakan 60 mesh
Lolos ayakan 60 mesh	
% b/b
% b/b	
Min. 95
100	
4.	Air	% b/b	Maks. 10	
5.	Serat kasar	% b/b	Maks. 3.0	
6.	Derajat asam	Ml N. ml N	Maks. 2.0	
(Sumber : SNI 01-3728-1995)
Kacang hijau banyak menghasilkan olahan produk yang menambah daya simpan yang lebih panjang, seperti cookies kacang hijau. Tepung kacang hijau menurut SNI 01-3728-1995 adalah bahan makanan yang diperoleh dari biji tanaman kacang hijau (Phaseolus radiatus L) yang sudah dihilangkan kulit arinya dan diolah menjadi tepung. 
2.2.2 Tepung Kacang Merah
Kacang merah (Phaseolus vulgaris L) bukan tanaman asli Indonesia, namun banyak dijumpai di Indonesia. Beberapa literatur memastikan bahwa spesies Phaseolus vulgaris L tipe tegak (kidney beans) atau di Indonesia disebut kacang jogo/ kacang merah, merupakan tanaman asli di lembah Tahuacan, Meksiko (Rukmana, 2009). Rukmana (2009) lebih lanjut mengemukakan, kedudukan tanaman kacang merah dalam tata nama tumbuhan diklasifikasikan sebagai berikut :
Kingdom 	: Plant Kingdom
Divisi		: Spermatophyta
Subdivisi 	: Angiospermae
Kelas 		: Dicotyledonae
Subkelas	: Calyciflorae
Ordo 		: Rosales (Leguminales)
Family		: Leguminosae (Papilionaceae)
Subfamily 	: Papilionoideae
Genus 		: Phaseolus
Spesies 	: Phaseolus vulgaris L.
Biasanya yang dimanfaatkan dari kacang merah adalah bijinya. Biji kacang merah merupakan bahan makanan yang mempunyai energi tinggi dan sekaligus sumber protein nabati yang potensial, karena itu peranannya dalam usaha perbaikan gizi sangatlah penting. Selain kaya akan protein, biji kacang merah juga merupakan sumber karbohidrat, mineral dan vitamin. Kandungan vitamin per 100 g biji adalah : vitamin A 30 SI, thiamin/ vitamin B1 0,5 mg, riboflavin/ vitamin B2 0,2 mg, serta niasin 2,2 mg (Astawan, 2009). 
Tabel 8. Komposisi zat gizi per 100 gram Kacang Merah
Zat Gizi	Kadar per 100 Gram	
Air (g)	13	
Energi (kkal)	350	
Protein (g)	13,9	
Lemak (g)	3	
KH (g)	66,9	
Besi (mg)	6,8	
As. Folat (µg)	180	
(Sumber : Tabel Komposisi Pangan 2009)
Bila dibandingkan kacang - kacangan lainnya, kacang merah memiliki kadar karbohidrat yang tertinggi, kadar protein yang setara kacang hijau, kadar lemak yang jauh lebih rendah dibandingkan kacang kedelai dan kacang tanah, serta memiliki kadar serat yang setara dengan kacang hijau, kedelai dan kacang tanah. Kadar serat pada kacang merah jauh lebih tinggi dibandingkan beras, jagung, sorgum dan gandum. Apabila dibandingkan dengan sumber protein hewani keunggulan kacang merah adalah bebas kolesterol, sehingga aman untuk dikonsumsi oleh semua golongan masyarakat dari berbagai kelompok umur. Protein kacang merah juga dapat digunakan untuk menurunkan kadar kolesterol LDL yang bersifat jahat bagi kesehatan manusia, serta meningkatkan kadar kolesterol HDL yang bersifat baik bagi kesehatan manusia. Kacang merah merupakan sumber mineral yang baik. Komposisi mineral per 100,0 gram kacang merah kering adalah fosfor (410,0 mg), kalsium (260,0 mg), mangan (194,0 mg), besi (6,8 mg), tembaga (0,95 mg), serta natrium (15,0 mg). Kalsium sangat berguna untuk menjaga kesehatan tulang, sedangkan besi untuk mencegah anemia (Astawan, 2009). 
Kacang merah mampu memberikan protein yang setara daging, walaupun jenis protein yang terkandung di dalamnya adalah jenis protein yang tidak lengkap, tapi ada 1 asam amino esensial. Sebanyak 100,0 gram kacang merah kering, mampu menyumbangkan 4,0 gram serat, yang terdiri atas campuran serat larut dan tak larut. Serat larut mengalami proses fermentasi dalam usus besar, kemudian menghasilkan asam - asam lemak rantai pendek, yang dapat menghambat sintesis kolesterol hati (Afriansyah, 2010).
Kacang merah kering adalah sumber karbohidrat kompleks, serat makanan (fiber), vitamin B (terutama asam folat dan vitamin B6), fosfor, mangan, besi, thiamin, dan protein. Setiap 100,0 gram kacang merah kering yang telah direbus dapat menyediakan 9,0 gram protein atau 17,0 % dari angka kecukupan protein harian. Kandungan protein dan profil asam amino dalam 100,0 gram kacang merah (kidney bean) dari yang terbanyak adalah lisin (1323,0 mg), asam aspartat (1049,0 mg), leusin (693,0 mg), asam glutamat (595,0 mg), arginin (537,0 mg), serin (472,0 mg), phenilalanin (469,0 mg), valin (454,0 mg), isoleusin (383,0 mg), proline (368,0 mg), treonin (365,0 mg), alanin (364,0 mg), glisin (339,0 mg), metionin (10,56 mg) dan sistein (8,46 mg) (Kay, 1979).
Pengolahan biji kacang merah menjadi tepung telah lama dikenal oleh masyarakat, namun diperlukan sentuhan teknologi untuk meningkatkan mutu tepung kacang merah yang dihasilkan. Pembuatan tepung kacang merah dapat dilakukan dengan cara mengeringkannya di bawah sinar matahari. Kacang merah kemudian dilepas kulitnya, disangrai, digiling, dan diayak menjadi tepung (Astawan, 2009). Keunggulan dari pengolahan kacang merah menjadi tepung kacang merah adalah meningkatkan daya guna, hasil guna, lebih mudah diolah atau diproses menjadi produk yang memiliki nilai ekonomi tinggi, lebih mudah dicampur dengan tepung-tepung dan bahan lainnya.
Tabel 9. Kandungan Gizi per 20 gram Tepung Kacang Merah
No.	Jenis Zat Gizi	Kandungan Zat Gizi	
1	Energi (kkal)	73,87	
2	Protein (gram)	4,57	
3	Lemak (gram)	0,48	
4	Karbohidrat (gram)	12,83	
(Sumber : Pangastuti dkk, 2013)
2.3. Protein
		Protein terbentuk dari unsur - unsur organik yang hampir sama dengan karbohidrat dan lemak yaitu terdiri dari unsur karbon, dan hidrogen dan oksigen akan tetapi ditambahkan dengan unsur lain yaitu nitrogen. Protein adalah bagian dari semua sel hidup dan merupakan bagian terbesar ubuh sesudah air. Seperlima bagian tubuh adalah protein, separuhnya ada di dalam otot, seperlima di dalam tulang dan tulang rawan, sepersepuluh di dalam kulit, dan selebihnya di dalam jaringan lain dan cairan tubuh (Almatsier, 2004).
		Protein memiliki beberapa fungsi, salah satu fungsi utama protein atau zat pembangun yaitu dalam pertumbuhan jaringan. Pertumbuhan dan pemeliharaan jaringan dimungkinkan bila tersedia susunan asam amino tertentu yang sesuai. Protein juga berfungsi juga sebagai sumber energi, namun jika penyediaan energi dan karbohidrat dan lemak tidak mencukupi. Selain itu, protein bersama vitamin dan mineral berperan dalam pemeliharaan keseimbangan air dengan cara menjaga jumlah cairan yang cukup di setiap ruang bagian cairan tubuh, yaitu cairan dalam pembuluh darah, ruang antar sel dan di dalam sel. 
		Fungsi protein lainnya adalah sebagai pengangkut zat gizi, contoh protein transpor yang terletak dalam membran sel bertindak sebagai pompa glukosa, kalium dan natrium. Pompa glukosa dan kalium memindahkan gula dan kalium ke dalam sel, lebih cepat dari pengeluarannya, sedangkan pompa kalium memindahkan natrium keluar sel lebih cepat dari jalur masuknya. Pompa protein pada membran sel mengatur glukosa dan kalium tinggi, sebaliknya konsentrasi natrium rendah di dalam sel dari pada media disekitarnya. Penyebaran natrium dan kalium melalui membran sel saraf memungkinkan rangsangan saraf berpindah untuk disampaikan ke fungsi otak untuk berpikir atau organ gerak lainnya. Contoh protein pengangkut lainnya yaitu calcium binding protein di dalam saluran usus, yang memindahkan mineral kalsium kedalam sel. 
		Protein pengangkut lainnya yaitu lipoprotein, yang memindahkan lipid dari darah ke jaringan yang memerlukannya. Kalmodulin adalah protein yang membawa pesan kalsium. Pada proses pemindahan zat besi ke dalam sel, protein sel usus yaitu feritin menangkap Fe dan akan dilepas jika diperlukan. Transferin, protein dalam saluran darah, yang membawa zat besi ke tempat penyampaiannya, sumsum tulang atau jaringan lainnya. Jika diperlukan, zat besi akan bergabung kembali dengan protein sel darah merah (hemoglobin), membantu pemindahan oksigen, atau ke protein otot (mioglobin) membantu oksidasi sel otot untuk mendapatkan energi (Tejasari, 2005).
	Bahan makanan hewani merupakan sumber protein yang baik, dalam jumlah maupun mutu, seperti telur, susu, daging, unggas, ikan dan kerang. Sumber protein nabati adalah kacang kedelai dan hasilnya, seperti tempe dan tahu, serta kacang – kacangan lainnya (Almatsier, 2004). Kandungan protein beberapa bahan makanan dapat dilihat pada Tabel 10. 
Tabel 10. Nilai Protein berbagai bahan makanan (gram/100 gram)
Bahan Makanan	Nilai Protein	
Kacang Kedelai	40,4	
Kacang Merah	13,9	
Kacang Tanah	27,9	
Kacang Hijau	22,9	
(Sumber : Tabel Komposisi Pangan Indonesia 2009)
2.4. Zat Besi
Zat besi merupakan unsur yang sangat penting dalam pembentuk hemoglobin (Hb). Untuk memenuhi kebutuhan dalam pembentukan hemoglobin sebagian zat besi berasal dari pemecahan sel darah merah yang akan dimanfaatkan kembali, dan kekurangannya harus dipenuhi dan diperoleh melalui makanan. Zat besi dalam tubuh mempunyai fungsi yang berhubungan dengan pengangkutan, penyimpanan dan pemanfaatan dalam bentuk hemoglobin, mioglobin atau cytochrome. Kandungan zat besi di dalam tubuh wanita sekitar 35,0 mg/kg BB. Terdapat 70,0% dalam hemoglobin dan 25,0% merupakan besi cadangan yang terdiri dari feritin yang berfungsi sebagai tempat penyimpanan besi dan hemosiderin yaitu kumpulan dari molekul feritin yang terdapat dalam hati, limpa dan sumsum tulang belakang. 
Jumlah besi yang dapat disimpan dalam tubuh pada wanita dewasa adalah 0,3 - 1,0 gr. Pembuangan besi keluar tubuh terjadi melalui beberapa jalan diantaranya melalui keringat 0,2 - 1,2 mg/ hari , air seni 0,1 mg/hari,  melalui feses dan menstruasi 0,5 - 1,4 mg/hari (Andriani & Wirjatmadi, 2012). Almatsier (2009) menyebutkan sekitar 5,0 - 15,0% besi makanan diabsorpsi oleh orang dewasa yang berada dalam status besi baik, sedangkan dalam keadaan defisiensi absorpsi dapat mencapai 50,0%. Banyak faktor yang berpengaruh terhadap absorpsi besi diantaranya yaitu bentuk besi dalam makanan, vitamin C dan faktor penghambat penyerapan besi seperti asam fitat dan oksalat, serta tanin. 
Bentuk besi dalam makanan berpengaruh terhadap penyerapan, dimana besi hem yang merupakan bagian dari hemoglobin dan myoglobin yang terdapat dari protein hewani dapat diserap dua kali lipat dari pada besi nonhem. Kurang lebih 40,0 % dari besi didalam daging, daging ayam, dan ikan merupakan besi hem dan sisanya besi nonheme. Besi nonhem juga terdapat pada telur, serealia, kacang-kacangan, sayuran hijau dan beberapa jenis buah-buahan. Menurut Almatsier (2009) mengkonsumsi besi hem dan nonhem secara bersamaan dapat meningkatkan penyerapan besi nonhem. Daging, unggas, dan ikan mengandung suatu faktor yang membantu penyerapan besi. Faktor ini terdiri atas asam amino yang mengikat besi dan membantu penyerapan. Besi yang ada dalam tubuh berasal dari tiga sumber yaitu besi yang diperoleh dari perusakan sel - sel darah merah (hemolisis), besi yang diambil dari penyimpanan dalam tubuh dan besi yang diserap dari saluran pencernaan. Berdasarkan ketiga sumber tersebut pada manusia yang normal kira - kira 20 - 25 mg besi perhari berasal dari hemolisis dan sekitar 1 mg berasal dalam jumlah terbatas. Keadaan normal, diperkirakan seorang dewasa menyerap dan mengeluarkan besi dalam jumlah terbatas pada jejenum dan ileum. Proses penyerapan zat besi yaitu :
1)	Besi yang terdapat dalam bahan pangan, baik dalam bentuk ferri (Fe+++) atau ferro (Fe++) mula-mula mengalami proses pencernaan.
2)	Di dalam usus, ferri larut dalam asam lambung kemudian diikat oleh gastroferin dan direduksi menjadi ferro.
3)	Di dalam usus, ferro dioksidasi menjadi ferri. Ferro selanjutnya berikatan dengan apoferritin yang kemudian ditransformasi menjadi ferritin, membebaskan ferro ke dalam plasma darah. 
4)	Di dalam plasma Fe++ dioksidasi jadi Fe+++ dan berikatan dengan transferin.
5)	Transperin mengangkut ferro ke dalam sumsum tulang untuk bergabung membentuk hemoglobin. 
Transferin mengangkut ferro ke dalam tempat penyimpanan besi dalam tubuh (hati, tulang, limpa, sistem reticulendotelial), kemudian dioksidasi menjadi ferri. Ferri ini bergabung dengan apoferritin membentuk feritin yang kemudian disimpan. Besi yang terdapat dalam plasma seimbang dengan yang disimpan. 
Pada saluran pencernaan zat besi mengalami proses reduksi dari bentuk ferri (Fe+++) menjadi bentuk ferro (Fe++) yang mudah diserap. Proses penyerapan ini dibantu oleh asam amino dan vitamin C. Vitamin C meningkatkan absorpsi zat besi dari makanan melalui pembentukan kompleks feroaskorbat. Vitamin C membentuk gugus besi askorbat yang tetap larut pada pH lebih tinggi dalam duodenum. Oleh karena itu sangat dianjurkan memakan makanan sumber vitamin C tiap kali makan. Zat besi berperan sebagai komponen enzim dan terlibat dalam beberapa proses metabolisme. Hepcidin adalah salah satu protein yang berperan meregulasi kadar zat besi dalam darah. Kadar hepcidin dalam tubuh dapat dipengaruhi oleh beberapa kodisi, salah satunya adalah rendahnya kadar besi di dalam tubuh. Hepcidin juga berperan menjaga kadar zat besi di dalam tubuh (Perdana & Jacobus, 2015).
Besi merupakan mineral mikro yang paling banyak terdapat dalam tubuh manusia dan hewan, yaitu sebanyak 3,0  - 5,0 gram. Jumlah total didalam tubuh berkisar kira-kira 4,0  gr. Lebih kurang 4,0% dari jumlah tersebut dapat dijumpai dalam bentuk hemoglobin, 1,0 % dalam bentuk bermacam-macam senyawa heme yang dapat meningkatkan oksidasi intraselular 0,1% berikatan dengan protein transferin yang terdapat dalam plasam darah dan 15,0 - 30,0% disimpan terutama di hati. Besi dalam makanan yang dikonsumsi berada dalam bentuk ikatan Ferri (secara umum dalam bahan pangan nabati) dan ikatan Ferro mudah terabsorbsi (dalam bahan pangan hewan) (Almatsier, 2001). Fungsi utama zat besi bagi tubuh adalah untuk mengangkut oksigen dan karbondioksida serta untuk pembentukan darah. 
Sebagian besar besi berada di dalam hemoglobin, yaitu molekul protein yang mengandung besi dari sel darah merah dan mioglobin di dalam otot. Hemoglobin di dalam darah membawa oksigen dari paru - paru keseluruh tubuh dan membawa kembali karbondioksida dari seluruh sel ke paru-paru untuk dikeluarkan dari tubuh (Khomsan, 2003). Bentuk konjugasi Fe itu adalah:
1)	Hemoglobin mengandung bentuk ferro.
2)	Myoglobin terdapat di dalam sel - sel otot, mengandung Fe bentuk ferro.
3)	Transferrin mengandung Fe bentuk ferro yang berfungsi mentransfor Fe tersebut di dalam plasma darah.
4)	Ferritin adalah bentuk storage Fe, dan mengandung bentuk ferri.
5)	Hemosiderin adalah konjugat protein dengan ferri dan merupakan bentuk storage zat besi juga.
Zat besi terdiri dari zat besi heme dan non heme, zat besi heme yang ada pada makanan akan diserap melewati mukosa enterocytes. Heme yang masuk pada cytosol secara enzymatis akan dirubah menjadi feroporphyrin kompleks. Ion zat besi (Fe++) yang terbentuk akan berikatan dengan apoferritin menjadi ferritin, pada saat yang sama zat besi non heme akan berikatan dengan apoferritin. Penyerapan zat besi heme dan non heme selanjutnya di membran basolateral yang dengan mekanisme transpor aktif masuk ke dalam darah (Kathleen dan Ascott, 2000). Manusia hanya mampu menyerap dan membuang/ mengeluarkan  zat besi dalam jumlah yang terbatas. Orang dewasa diperkirakan menyerap dan mengeluarkan besi sekitar 0,5 - 2,0 mg per hari. 
Sebagian penyerapan di duodenum tetapi dalam jumlah terbatas juga terdapat pada jejunum dan ileum. Badan manusia lebih cenderung menggunakan kembali besi yang ada dalam tubuh daripada membuang keluar tubuh (Almatsier, 2001). Penyerapan zat besi dari berbagai jenis makanan telah diteliti oleh Martinez dan Torres yang mengadakan penelitian pada 524 orang sampel dengan hasil sebagai berikut :
Tabel 11. Penyerapan Zat Besi (Fe) dari Beberapa Jenis Bahan Makanan
Bahan Makanan	% Penyerapan	
Beras	1,0%	
Kedelai	6,0%	
Jagung	3,0%	
Ikan	11,0%	
Hati	13,0%	
(Sumber : Winarno, 2002)
Berdasarkan hasil tabel di atas bahan makanan sumber Fe dari beras mempunyai persen penyerapan sebesar 1,0%, jagung sebesar 3,0%, kedelai sebesar 6,0%, ikan sebesar 11,0% dan hati sebesar 13,0%, sehingga bahan makanan sumber Fe yang berasal dari bahan makanan hewani mempunyai persen penyerapan yang lebih tinggi (Winarno, 2002). 
Penyerapan zat besi dipengaruhi oleh banyak faktor diantaranya adanya vitamin C yang dapat meningkatkan penyerapan zat besi dari makanan, jenis protein hewani yang dapat meningkatkan penyerapan zat besi, kelebihan fosfat dalam usus membentuk besi - fosfat sehingga tidak dapat diserap dan penyakit infeksi juga dapat menurunkan penyerapan zat besi (Sarwono, 1997).
2.4.1 Sumber Zat Besi
Zat besi heme terdapat pada daging, ikan, dan ayam sedangkan zat besi non heme terdapat pada telur, padi - padian, sayur - sayuran, dan buah - buahan. Daya serap zat besi berbeda untuk tiap bahan pangan seperti pada telur zat besi yang terserap sekitar 2,0 - 6,0%, pada daging ayam sekitar 11,0%, pada bayam sekitar 1,0% dan pada jagung sekitar 3,0%, orang yang dalam keadaan normal dapat menyerap zat besi 5,0 - 10,0% (Kathleen dan Escott, 2000).
Tabel 12. Kandungan Zat Besi dalam Bahan Makanan
Bahan Makanan	Zat Besi (mg/100g)	
Hati	6,0 – 14,0	
Daging sapi	2,0 – 4,3	
Telur ayam	2,0 – 3,0	
Kacang-kacangan	1,9 – 14,0	
Tepung gandum	1,5 – 7,0	
Ikan	0,5 – 1,0	
beras	0,5 – 0,8	
Umbi-umbian	0,3 – 2,0	
Buah-buahan	0,2 – 4,0	
Susu sapi	0,1 – 0,4	
(Sumber : Winarno, 2002)
Berdasarkan tabel di atas bahan makanan yang mempunyai kandungan zat besi (Fe) yang tinggi yaitu hati sebesar 6,0 - 14,0 mg/100g sedangkan bahan makanan yang mempunyai kandungan zat besi (Fe) yang paling rendah yaitu susu sapi sebesar 0,1 - 0,4 mg/100g (Winarno, 2002).

2.4.2 Konsumsi Zat Besi
Kekurangan zat besi dalam tubuh disebabkan oleh konsumsi besi yang rendah dan cadangan besi dalam tubuh tidak mencukupi kebutuhan untuk pembentukan sel darah merah. Bila cadangan besi yang tidak mencukupi secara terus menerus maka dapat mengakibatkan pembentukan sel darah merah berkurang selain itu, kekurangan zat besi dapat terjadi karena perdarahan akibat cacingan atau luka, dan akibat penyakit - penyakit yang mengganggu absorbsi seperti penyakit gastrointestinal (Almatsier, 2004). Kadar zat gizi besi pada seseorang sangat dipengaruhi oleh jumlah konsumsi melalui makanan, bagian yang diserap melalui saluran pencernaan, cadangan zat besi dalam jaringan, aksresi dan kebutuhan tubuh. 
Kebutuhan zat besi pada remaja dibutuhkan lebih tinggi karena masa remaja adalah pertumbuhan yang sangat cepat terutama pada wanita remaja yang sudah mendapat haid akan kehilangan zat besi lebih besar dari 1.2 mg/hari. Kandungan zat besi dalam tubuh sangat kecil yaitu 35 mg/kg BB wanita atau 50 mg/kg BB pria, besi dalam tubuh terletak dalam sel-sel darah merah sebagai heme juga terdapat dalam sel - sel otot khususnya dalam mioglobin berbeda dengan hemoglobin, mioglobin terdiri dari satu pigmen heme untuk setiap protein (Winarno, 2002).
2.4.3 Absorbsi Zat Besi
Absorbsi besi sangat tergantung pada jumlah dalam bahan makanan yang menghambat dan meningkatkan absorbsi, sehingga absorbsi besi dari makanan yang dikonsumsi sehari - hari bervariasi antara 5,0 - 10,0%. Masyarakat yang banyak mengkonsumsi bahan makanan yang berasal dari hewani seperti di negara Eropa, Amerika serikat dan negara maju lainnya absorbsi zat besi dari makanan yang dikonsumsinya dapat berkisar antara 10,0 - 20,0% sedangkan di negara-negara berkembang hanya berkisar antara 5,0 - 10,0% (Almatsier, 2001). Berdasarkan pertimbangan sebelumnya maka makanan sehari - hari dapat diklasifikasikan menjadi 3 yaitu :
1)	Absorbsi zat besi rendah (5,0%)
Makanan pada umumnya monoton hanya terdiri dari beras atau ubi atau jagung dengan sedikit atau jarang sekali makan daging, ikan dan vitamin C serta lebih banyak mengkonsumsi serat atau bahan makanan yang menghambat absorbsi besi maka absorbsi besi dengan menu makanan yang demikian adalah rendah (5,0%). Makanan yang absorbsinya rendah biasa dijumpai pada masyarakat di negara - negara sedang berkembang yang umumnya berpenghasilan rendah.
2)	Absorbsi zat besi sedang (10,0%)
Makanan yang terdiri dari beras atau serealia lainnya dengan daging dan makanan yang berasal dari hewani lainnya serta vitamin C yang sering ada setiap hari termasuk dalam absorbsi besi sedang/ moderat (10,0%) merupakan tipe makanan bagi masyarakat di negara berkembang.
3)	Absorbsi zat besi tinggi (15,0%)
Menu makanan orang di negara industri biasanya dengan daging dan bahan makanan tinggi lainnya di dalam menu sehari - hari maka termasuk absorbsi besi dari makanan tinggi (15,0%) (Almatsier, 2001). WHO menganjurkan bahwa jumlah besi yang harus dikonsumsi sebaiknya berdasarkan kehilangan besi dari dalam tubuh serta jumlah bahan makanan hewani yang terdapat dalam menu kita. Jumlah besi yang dikeluarkan tubuh sekitar 1,0 mg perhari. Untuk wanita masih ditambah 1,5 mg hilang karena menstruasi (Winarno, 2002). Metabolisme asam folat sangat erat hubungannya dengan fungsi vitamin B12 dan vitamin C. Defisiensi asam folat memberi gambaran klinik anemia megaloblastik di dalam sumsum tulang dan makristik di dalam darah Perifer. Asam folat banyak tersebar di dalam berbagai jenis bahan makanan nabati maupun hewani. Bahan makanan sumber vitamin B12 pada umunya merupakan bahan makanan hewani. Sumber yang cukup kayak akan vitamin ini adalah hati, ginjal, otak, jantung, jeroan dan kuning telur (Sediaoetama, 2000).
Tabel 13. Angka Kecukupan Gizi yang Dianjurkan untuk Zat Besi
Jenis Kelamin	Usia	AKG	
Laki – laki	10 -12 tahun	13 mg	
Laki – laki	13 – 15 tahun	19 mg	
Laki - laki	16 – 18 tahun	15 mg	
Laki - laki	19 – 29 tahun	13 mg	
Perempuan	10 – 12 tahun 	 20 mg	
Perempuan	13 – 15 tahun	26 mg	
Perempuan	16 -18 tahun	26 mg	
Perempuan	19 – 29 tahun	26 mg	
(Sumber : Kemenkes 2013 Berdasarkan WNPG 2012)
2.5. Berat Badan
Menurut Waspadji dan Suyono (2003), berat badan adalah salah satu dari ukuran tubuh pada pengukuran antropometrik yang sudah sejak lama digunakan dalam penentuan status gizi. Tujuan penimbangan berat badan merupakan suatu usaha untuk mengantisipasi masalah gizi dan kesehatan lainnya yang dapat timbul melalui perubahan berat badan. Berat badan menggambarkan jumlah protein, lemak, air dan mineral pada tulang. Hasil pengukuran berat badan dapat dijadikan parameter antropometri pilihan utama antara lain karena :
1)	Parameter yang paling baik, mudah terlihat perubahannya dalam waktu singkat karena perubahan konsumsi makanan dan kesehatan.
2)	Memberikan gambaran status gizi sekarang dan jika dilakukan secara periodik memberikan gambaran yang baik tentang pertumbuhan.
3)	Merupakan ukuran antropometri yang sudah dipakai secara umum dan luas di Indonesia sehingga bukan merupakan hal baru yang memerlukan penjelasan secara luas.
4)	Ketelitian pengukuran tidak banyak dipengaruhi oleh keterampilan pengukuran.
5)	Alat ukur berat badan dapat diperoleh dengan mudah meski di daerah pedesaan (Supariasa, 2014).
Penentuan berat badan dilakukan dengan cara menimbang. Alat yang digunakan dilapangan sebaiknya memenuhi beberapa persayaratan :
1.	Mudah digunakan dan dibawa dari satu tempat ke tempat yang lain.
2.	Mudah diperoleh dan harga yang relatif murah.
3.	Ketelitian penimbangan maksimum 0,1 kg dan skala mudah dibaca.
2.6. Kadar Hemoglobin
Hemoglobin adalah substansi protein dalam sel – sel darah merah yang terdiri dari zat besi, yang merupakan pembawa oksigen, hemoglobin mengandung bentuk ferro. Fungsi hemoglobin adalah mentranspor CO2 dari jaringan ke paru-paru untuk diekskresikan kedalam udara pernafasan dan membawa O2 dari paru-paru ke sel - sel jaringan (Sediaoetama, 2000). Hemoglobin meupakan zat warna yang terdapat dalam darah merah yang berguna untuk mengangkut oksigen dan CO2 dalam tubuh. Selain berfungsi sebagai pengangkut oksigen, hemoglobin ini juga membawa karbondioksida dan hidrogen ke paru - paru tempat zat - zat tersebut dilepaskan dari hemoglobin. Hemoglobin diurai di hati dan limpa (Corwin, 2000; Wardlaw & Hampl, 2007). 
Sel darah merah memiliki bagian-bagian penting dalam menjalankan fungsinya, yaitu hemoglobin (Hb), transferin, dan feritin. Menurut Florence & Setright (1994), hemoglobin adalah suatu protein yang mengandung heme bergabung dengan protein globin dengan empat unitnya membentuk hemoglobin. Transperin disintesis dalam hati dan berperan dalam metabolisme besi, terutama transpor besi ke seluruh tubuh (Sadikin, 2002).
Proses pembentukan sel darah merah dinamakan eritropoiesis. Eritropoiesis dimulai dengan perubahan hemositoblas menjadi proeritroblas. Proeritroblas menjadi eritroblas awal yang kemudian berkembang menjadi intermediet eritroblas, dan pada tahap ini hemoglobin mulai terbentuk. Tahap selanjutnya yaitu terbentuknya eritroblas akhir dimana sintetis hemoglobin mencapai batas maksimum. Eritroblas akhir ini kemudian berkembang menjadi retikulosit, sebuah sel yang berisi 34,0% hemoglobin, beberapa mitokondria dan ribosom serta kehilangan inti sel. Retikulosa ini kemudian dilepaskan dari sumsum tulang ke dalam aliran darah. Umumnya retikulosis ini berkembang menjadi eritrosit yang di lepaskan dari sumsum tulang (Corwin, 2000; Wardlaw & Hampl, 2007). 
Sel darah merah hidup sekitar 120 hari sebelum mengalami disintegrasi dan mati. Sel darah merah yang mati diganti oleh sel baru yang dihasilkan oleh sumsum tulang. Apabila sel darah merah tersebut mulai berdisintegrasi pada akhir masa hidupnya, sel tersebut mengeluarkan hemoglobinnya ke dalam sirkulasi. Molekul globulin diuraikan menjadi asam-asam amino yang digunakan kembali oleh tubuh. Besi disimpan di hati dan limpa sampai digunakan kembali. Sisa molekul lainnya diubah menjadi bilirubin, yang kemudian diekskresi melalui tinja sebagai empedu atau melalui urin (Corwin, 2000; Wardlaw & Hampl, 2007). 
Parameter yang biasa digunakan untuk mendeteksi keadaan anemia gizi seseorang adalah kadar hemoglobin (Hb). Cara penentuan kadar kadar hemoglobin yang dianggap cukup teliti dan dianjurkan oleh International Communite for Standarrization in Hematology (ICSH) adalah Cyanmethemoglobin (Sediaoetama, 2000). Adapun cara lain yang dapat dilakukan untuk menentukan kadar hemoglobin darah adalah metode sahli, dimana metode sahli dapat menentukan nilai rata - rata 10,0% lebih rendah dari hasil penentuan dengan Cyanmethemoglobin jika penelitian dilakukan oleh orang yang berpengalaman. Kelebihan dari Cyanmethemoglobin adalah :
1)	Cyanmethemoglobin adalah penentuan kadar hemoglobin yang bersifat kuantitatif.
2)	Larutan yang digunakan adalah larutan drabkins dimana dapat memisahkan plasma dengan packed cell dengan baik.
3)	Alat untuk mengetahui kadar hemoglobin menggunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm.
Kekurangan dari metode Cyanmethemoglobin adalah maksimal waktu dari pengambilan darah dan pengujiannya adalah 3 jam (Soebrata, 2000). Kadar baku hemoglobin dalam darah yang digunakan untuk menentukan apakah seseorang menderita anemia sebagai berikut :
Tabel 14. Batas Normal  Kadar Hemoglobin (Hb)
Kelompok	Kadar Hb ( gr% )	
Anak balita	11,0	
Anak usia sekolah	12,0 	
Wanita dewasa	12,0 	
Laki-laki dewasa	13,0 	
Ibu hamil	11,0 	
Ibu menyusui	12,0 	
(Sumber : WHO, 2000)
Quik - check adalah alat cek Hb dalam darah yang bekerja secara digital. Berfungsi untuk mendeteksi hemoglobin didalam tubuh manusia. Alat Hb hemoglobin quik - check monitoring system ini sangat akurat dan efektif dan sudah banyak digunakan di laboratorium di Indonesia. Bentuk yang simpel, mudah dibawa kemana saja, hanya menunggu beberapa saat maka hasil hemoglobin dapat segera diketahui. Cara menggunakan Quik - check :
1)	Masukan batere dan chip nyalakan mesin.
2)	Ambil strip Hb dan masukkan pada mesin Quik-check.
3)	Pada layar akan muncul angka/ kode sesuai pada botol strip, setelah itu akan muncul gambar tetes darah dan kedip - kedip.
4)	Masukan jarum pada lancing/ alat tembak berbentuk pen dan atur kedalaman jarum. Gunakan tisu alkohol untuk membersihkan jari, letakkan alat tembak pen tersebut pada jari dan tekan supaya darah keluar. Darah disentuh pada strip, sentuh pada bagian garis yang ada tanda panah. Darah akan langsung meresap sampai ujung strip.
5)	Tunggu sebentar, hasil akan keluar beberapa detik pada layar. Cabut jarumnya dari lancing juga stripnya dan buang. Chip Hb di simpan kembali pada botol.
6)	Tutup rapat botol strip jika tidak digunakan lagi.
7)	Perhatikan masa expired pada setiap strip. 
2.7. Wanita Usia Subur (WUS)
Mahasiswi merupakan bagian dari wanita usia subur yang sering dianggap sebagai orang yang telah mencapai tingkat kedewasaan ketika memasuki perguruan tinggi. Masa - masa ini merupakan masa yang paling rawan terhadap kesehatan. Kondisi kejiwaan dan gaya hidup merupakan penyebab yang paling umum terjadi masalah kesehatan. Terutama masalah kesehatan seperti KEK (Kekurangan Energi Kronis) dan Anemia. Permasalahan yang paling sering dihadapi adalah kebiasaan makan yang salah atau eating disorder (Ahmadi & Sholeh, 2005).
Mahasiswi merupakan kelompok populasi yang rawan terhadap defisiensi gizi khususnya defisiensi zat besi. Pada masa ini, mereka sedang dalam masa pertumbuhan puncak (peak growth), dan dibutuhkan zat besi yang lebih tinggi untuk kebutuhan basal tubuh dan pertumbuhan itu sendiri. Kebutuhan zat besi yang tinggi pada saat peak growth akan menetap karena selanjutnya diperlukan untuk mengganti zat besi yang hilang pada saat menstruasi atau haid (Sediaoetomo, 2002). 
Mahasiswi termasuk kedalam golongan wanita usia subur dan produktif,  yaitu antara usia 17 - 25 tahun dengan status belum menikah, menikah atau janda. Wanita usia subur memiliki keadaan organ reproduksi yang berfungsi dengan baik, dimana puncak kesuburan ada pada rentang usia 20 - 29 tahun (Suparyanto, 2011). Menstruasi pada masa ini paling teratur dan siklus menstruasi bermakna untuk memungkinkan terjadinya kehamilan dan terjadi ovulasi kurang lebih 450 kali (Kumalasari, 2012). Pada usia ini, wanita memiliki kesempatan 95,0% untuk hamil. Pada usia ≥30 tahun mulai menurun menjadi 40,0%. Setelah usia 40 tahun wanita punya kesempatan maksimal untuk hamil hanya 10,0% (Suparyanto, 2011).
Pertumbuhan Wanita Usia Subur (WUS) masih dipengaruhi oleh perubahan hormonal, kognitif, serta emosi. Pada masa ini WUS memerlukan makanan dengan zat-zat gizi yang optimal agar pembentukan butir darah merah cukup. Apabila konsumsi makanan tidak mencukupi, kebutuhan gizi yang dibutuhkan tidak dapat terpenuhi sehingga status gizi akan terganggu. Hal ini berpengaruh pula pada penurunan tingkat kebugaran tubuh (Almatsier, 2009). 
2.8. Mencit Galur Swiss Webster
Sekitar 40,0 - 80,0% mencit digunakan sebagai hewan model laboratorium. Mencit banyak digunakan sebagai hewan laboratorium (khususnya digunakan dalam penelitian biologi), karena memiliki keunggulan - keunggulan seperti siklus hidup relatif pendek, jumlah anak per kelahiran banyak, variasi sifat - sifatnya tinggi dan yang terpenting yaitu mudah ditangani Moriwaki dkk (1994).  Sifat produksi dan karakteristik reproduksinya mirip hewan seperti sapi, kambing, domba, dan babi. Berat badan mencit pada umumnya bervariasi. Mencit umur empat minggu berat badannya bisa mencapai 10 - 18 gram. Kedudukan taksonomi dari mencit adalah sebagai berikut : 
Kingdom 	: Animalia 
Filum 		: Chordata 
Sub-Filum 	: Vertebrata 
Kelas 		: Mamalia 
Ordo 		: Rodentia 
Sub-Ordo 	: Myoimorphia 
Family		: Muridae 
Genus 		: Mus 
Spesies 	: Mus musculus (Arrington, 1972).
Mencit laboratorium mempunyai berat badan yang relatif sama dengan mencit liar, dan umumnya berwarna putih dengan jumlah galur yang banyak dan berat badan yang berbeda - beda (Smith dan Mangkoewidjojo, 1988). Mencit dapat hidup hingga umur 1 - 3 tahun, akan tetapi terdapat perbedaan usia dari berbagai galur terutama berdasarkan kepekaan terhadap lingkungan dan penyakit. Selama hidupnya, hewan ini beranak selama 7 - 18 bulan dan menghasilkan anak rata - rata 6 - 10 anak/ kelahiran. Mencit bila diperlakukan dengan baik akan memudahkan penanganan, sebaliknya perlakuan yang kasar akan menimbulkan sifat agresif bahkan dapat menggigit pada kondisi tertentu. Mencit betina yang sedang menyusui anak akan mempertahankan sarangnya dan bila anaknya dipegang dengan tangan yang kotor, induknya akan menggigit dan memakan anak tersebut (Malole dan Pramono, 1989). 
Zat gizi yang dibutuhkan mencit untuk pertumbuhan hampir sama dengan manusia yaitu karbohidrat yang terdiri dari pati, selulosa, gula, minyak atau lemak terutama linoleat dan linolenat, protein terutama asam amino esensial, mineral mikro, vitamin baik yang larut dalam air maupun larut dalam lemak (Muchtadi, 1989). Tingkat energi dalam ransum menentukan banyaknya ransum yang dikonsumsi. Ransum yang tinggi kandungan energinya harus diimbangi dengan protein, mineral dan vitamin yang cukup untuk ternak agar tidak mengalami defisiensi protein vitamin dan mineral (Mujiasih, 1999). 
Seekor mencit dewasa membutuhkan setidaknya lima gram makanan dan 15 ml air minum, bervariasi tergantung temperatur kandang, kelembaban, kualitas makanan, kesehatan dan kadar air dalam makanan (Malole dan Pramono, 1989). Menurut Smith dan Mangkuwidjojo (1988) seekor mencit dewasa dapat mengkonsumsi ransum dengan komposisi protein 17,0%; lemak 5,0%; serat kasar 5,0%; abu 4,0 - 5,0%.