II TINJAUAN PUSTAKA
2.1. Klasifikasi dan Botani Tanaman Ubi Kayu
Famili euphorbiaceae adalah famili tumbuhan berbunga yang terdiri dari 300 genus dan meliputi 7.500 spesies tumbuhan dimana hampir semuanya merupakan tumbuhan herba namun beberapa diantaranya, terutama yang berada di daerah tropis adalah perdu dan pohon 
Tumbuhan ubi kayu (Manihot utilissima Pohl.) merupakan tanaman pangan berupa perdu dengan nama lain ketela pohon, singkong, atau cassava. Ubi  kayu berasal dari Negara Amerika Latin, atau tepatnya dari Brazil. Penyebarannya hampir ke seluruh dunia, antara lain Afrika, Madagaskar, India, serta China. Ketela pohon/ ubi kayu diperkirakan masuk ke Indonesia pada tahun 1852. Sistematika tanaman ketela pohon / ubi kayu adalah sebagai berikut: 
Kingdom : Plantae 
Divisi 	 	: Spermatophyta (tumbuhan biji) 
Kelas  		: Dicotyledoneae (biji berkeping dua) 
Ordo		:  Euphorbiales 
Famili 		: Euphorbiaceae 
Genus 		:  Manihot 
Spesies 	:  Manihot utilissima Pohl. 
 	Ubi kayu sebagai bahan baku sumber energi alternatif memiliki kadar karbohidrat sekitar 32-35% dan kadar pati sekitar 83,8% setelah diproses menjadi tepung. Tanaman ubi kayu sebagai bahan baku bioetanol dapat tumbuh di lahan yang kurang subur serta masa panennya  tidak tergantung pada musim sehingga panennya dapat berlangsung sepanjang tahun. Oleh karena itu, dikatakan bahwa ubi kayu merupakan bahan baku yang potensial untuk pembuatan bioetanol (Prihardana, 2008). 
2.2. Onggok (Ampas Tapioka)
	Industri pengolahan tepung tapioka ini  mempunyai efek samping berupa limbah padat dan cair. Limbah industri tapioka termasuk limbah organik, karena ditimbulkan sebagai sisa dari pengolahan ketela pohon yang merupakan salah satu 
bahan organik. Onggok diperoleh dari proses pemarutan dan pengepresan, apabila tidak ditangani dengan seksama onggok dapat menimbulkan potensi besar mencemari lingkungan. Sebagian besar industri topioka berlokasi dekat pemukiman penduduk padat dan ditepi sungai sehingga onggok yang dibuang disekitar lokasi industri akan berakibat fatal bagi lingkungan dan makhluk hidup yang mendiami daerah sekitar. Proses pengolahan singkong menjadi tepung tapioka, menghasilkan limbah sekitar 2/3 bagian atau sekitar 80% dari bahan mentahnya, limbah ini biasa disebut onggok.
Dalam keadaan kering onggok mengeluarkan bau tidak sedap, apalagi dalam keadaan basah saat musim hujan. Bau tidak sedap ini muncul akibat terjadinya proses pembusukan onggok yang sangat cepat.    Meskipun merupakan limbah tetapi kandungan karbohidrat masih tinggi yaitu mencapai 63%-80%, sementara kadar airnya 20%. Tingginya kandungan karbohidrat dan kadar air inilah yang mempermudah akitivitas mikroba pengurai. Proses penguraian bisa bersifat aerob (membutuhkan oksigen) dan bisa pula bersifat anaerob (tidak membutuhkan oksigen). Dalam proses penguraian ini dihasilkan bau berupa H2S dan NH3  serta berbagai gas berbau menyengat lainnya. Meskipun disimpan dalam tempat khusus, bau  tidak sedap ini tetap sulit dicegah penyebarannya. Limbah padat industri tapioka masih mengandung pati cukup tinggi yaitu 63%.
Tabel 1. Komposisi Kimia Ampas Tapioka (Onggok)
No	Parameter	Komposisi Kandungan (%)	
		Onggok (%)a)	Onggok (%)b)	
1	Karbohidrat	34,75	40,26	
2	Serat	32,5	33,1	
3	Protein	0,93	0,93	
4	Lemak	0,19	0,19	
5	Air	27,63	17,84	
6	Abu	3,99	0,51	
Sumber: Apsari, A.D (2012)a), Rahmasari, S (2012)b)
2.3 Pati
Pati adalah cadangan makanan utama pada tanaman yang merupakan campuran dua polisakarida. Senyawa polisakarida adalah senyawa yang mengandung banyak (poli) satuan-satuan monosakarida yang ikat-mengikat melalui oksigen. Pati merupakan homopolimer glukosa dengan ikatan                  α-glikosidik. Berbagai macam pati tidak sama sifatnya, tergantung dari panjang rantai karbonnya dan cabang rantai molekulnya. Pati terdiri dari dua fraksi yang dapat dipisahkan dengan air panas. Fraksi terlarut disebut amilosa dan fraksi tidak larut disebut amilopektin. Amilosa mempunyai struktur lurus dengan ikatan        α-(1,4)-D-glukosa, sedangkan amilopektin mempunyai cabang dengan ikatan      α-(1,6)-D-glukosa sebesar 4 sampai 5 persen dari berat total (Winarno, 1992).
Gaman dan Sherrington (1992) mengatakan bahwa pati pada tanaman terdapat granula-granula kecil. Lapisan luar dari setiap granula terdiri atas molekul-molekul pati yang tersusun amat rapat, sehingga tidak tertembus air dingin. Sumber pati asal tanaman yang berbeda mempunyai ciri khas pada bentuk dan pada penyebaran ukuran-ukuran granula pati.
	Granula pati dalam keadaan murni mempunyai warna putih, mengkilat, tidak berbau dan tidak berasa. Granula pati melalui mikroskop dapat dilihat bahwa granula pati terbentuk oleh molekul-molekul yang membentuk lapisan tipis yang tersusun terpusat. Granula pati bervariasi dalam bentuk dan ukuran, ada yang berbentuk bulat, oval ataupun bentuk tak beraturan demikian juga ukurannya, mulai kurang dari 1 mikron sampai 150 mikron.
	Granula pati dapat dilihat dengan mikroskop karena pati memiliki sifat birefringent. Sifat birefringent pati yaitu sifat dari granula pati yang dapat merefleksikan cahaya terpolarisasi sehingga di bawah mikroskop terlihat kristal hitam putih (Winarno, 1992).
	Pati tersusun paling sedikit oleh tiga komponen utama, yaitu amilosa, amilopektin dan material antara seperti protein dan lemak. Struktur dan jenis material antara tiap sumber pati berbeda tergantung dari sifat-sifat botani sumber pati tersebut 
2.3.1  Amilosa
	Amilosa merupakan rantai linear yang terdiri dari 70 sampai 350 unit glukosa dengan ikatan α-1,4 glikosidik. Rantai lurus pada amilosa cenderung membentuk susunan pararel satu sama lain dan saling berikatan melalui ikatan hidrogen (Gaman,dkk,  1992).
Dalam konsentrasi tinggi, kumpulan-kumpulan molekul amilosa akan meningkat sampai titik tertentu dan akan terjadi pengendapan. Amilosa merupakan komponen yang berperan penting dalam menentukan sifat gel dan berperan juga dalam terjadinya retrogradasi.
 Banyak satuan glukosa dalam setiap rantai tergantung pada sumbernya. Biasanya setiap rantai mengandung 850 atau lebih unit glukosa dan dari setiap rantai lurus tersebut terdapat satu titik cabang ikatan α-(1,4) glikosida. Berat molekul amilosa beragam tergantung pada sumber dan metode ekstraksi yang digunakan. 

Gambar 1. Struktur Amilosa (Winarno, 1992)

2.3.2 Amilopektin
	Amilopektin merupakan molekul bercabang karena adanya ikatan α-1,6 pada titik tertentu dalam molekul. Cabangnya nisbi pendek dan mengandung sekitar 20 sampai 30 satuan glukosa.
Menurut Gaman dan Sherrington (1992), amilopektin merupakan komponen yang jauh lebih kompleks dan mempunyai berat molekul yang lebih besar daripada amilosa, mempunyai sifat-sifat yang tidak dapat membentuk kompleks dengan iodin, mempunyai kekentalan yang lebih rendah dibandingkan amilosa, dan memiliki daya kohesif yang sangat tinggi.
Amilopektin umumnya merupakan penyusun utama kebanyakan granula pati. Fraksi amilosa dalam granula pati berkisar antara 22 sampai 26 persen, sedangkan amilopektin mencapai 74-78 %. Perbandingan berat antara amilosa dan amilopektin pada suatau granula pati adalah beragam tergantung pada jenis tumbuhannya.

Gambar 2. Struktur Amilopektin (Winarno, 1992)
2.4. Saccharomyces cereviceae
Saccharomyces merupakan genus khamir/ragi/yeast yang memiliki kemampuan mengubah glukosa menjadi alkohol dan CO2. Saccharomyces merupakan mikroorganisme bersel satu tidak berklorofil, termasuk termasuk kelompok Eumycetes tumbuh baik pada suhu 30oC dan pH 4,8. Beberapa kelebihan Saccharomyces dalam proses fermentasi yaitu mikroorganisme ini cepat berkembang biak, tahan terhadap kadar alkohol yang tinggi, tahan terhadap suhu yang tinggi, mempunyai sifat stabil dan cepat mengadakan adaptasi. Beberapa spesies Saccharomyces cereviceae mampu memproduksi etanol hingga 13.01 %. Hasil ini lebih bagus dibanding genus lainnya seperti Candida dan Trochosporon. Pertumbuhan Saccharomyces cereviceae dipengaruhi oleh adanya penambahan nutrisi yaitu unsur C sebagai sumber carbon, unsur N yang diperoleh dari penambahan urea, ZA, amonium dan pepton, mineral dan vitamin. Suhu optimum untuk fermentasi antara 28 – 30 oC. Beberapa spesies yang termasuk dalam genus ini diantaranya yaitu Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces boullardii, dan Saccharomyces uvarum  
Dalam proses fermentasi menjadi etanol terjadi perubahan kimia yang disebabkan oleh adanya enzim yang dihasilkan oleh khamir. Reaksi kimia yang terjadi adalah sebagai berikut :
C12H22O11 + H2O → C6H12O6 + C6H12O6
   Sukrosa		glukosa       fruktosa
Glukosa dan fruktosa diuraikan oleh enzim zimase menjadi etanol dan gas CO2 serta sejumlah energi (Kavanagh, 2005). 
Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan dari khamir ini antara lain: 
a.  Kondisi lingkungan 
Suhu,  pH,  dan  oksigen  terlarut  (Dissolved  Oxygen-DO)  merupakan  faktor kondisi  lingkungan  yang  mempengaruhi  pertumbuhan  mikroorganisme.  Oleh karena  itu,  perlu  diatur  sedemikian  rupa  agar  pertumbuhan  biomassa  dapat optimal.  Khamir  bersifat  anaerobik  fakultatif.  Khamir  dalam  kondisi anaerobik  akan  melakukan  proses  fermentasi  dengan  mengkonversi  glukosa menjadi  etanol,  sedangkan  khamir  akan  menjalani  fase  pertumbuhan  dengan keadaan  sedikit  oksigen.  Kadar  oksigen  yang  dibutuhkan  oleh  khamir  untuk bertumbuh  adalah  0,05-0,10  mmHg  tekanan  oksigen.  Proses  fermentasi anaerobik  tidak  membutuhkan  oksigen  lebih  dari  itu,  karena  oksigen  yang berlebihan  akan  mendorong  pertumbuhan  khamir  dengan  cepat  dan mengkonsumsi  glukosa  (Trust,  2008). Saccharomyces  cerevisiae  memerlukan  suhu  30oC dan pH berkisar 4 hingga 4,5 agar dapat tumbuh dengan baik (Sassner, et.al,  2008). 
b.  Konsumsi glukosa 
Khamir memerlukan waktu beberapa menit agar dapat mengkonsumsi glukosa secara maksimal ketika  umpan  glukosa  dialirkan  ke  dalam  kultur.  Kapasitas penuh  konsumsi  glukosa  akan  hilang  jika  sel-sel  tidak  dirangsang  dengan konsentrasi  glukosa  yang  lebih  tinggi  untuk  beberapa  jam. Secara  kinetik glukosa  berperan  ganda,  pada  konsentrasi  rendah  (kurang  dari  1  g/l) merupakan  substrat  pembatas,  sedangkan  pada  konsentrasi  tinggi  (lebih  dari 300  g/l)  akan  menjadi  penghambat mengatakan bahwa konsentrasi gula dalam substrat yang umum digunakan di dalam industri adalah  sebesar  16-18%.  Apabila  konsentrasi  gula  lebih  tinggi dari  18%  akan  menyebabkan  tekanan  osmotik  yang  mengurangi  efisiensi proses fermentasi (Gaur, 2006).  

c.  Adaptasi terhadap etanol 
Khamir  yang  sering  digunakan  dalam  fermentasi  alkohol  adalah Saccharomyces  cereviceae,  karena  jenis  ini  dapat  berproduksi  tinggi,  toleran terhadap alkohol yang cukup tinggi (12-18% v/v) (Musanif, 2012).
Kebutuhan  unsur  mikro  diperlukan  di  dalam  kehidupan khamir.  Pada  jumlah  rendah  fosfor,  sulfur,  potasium  dan  magnesium diperlukan  untuk  sintesis  komponen-komponen  mineral.  Beberapa mineral (Mn,  Co,  Cu  dan  Zn)  dan  faktor  pertumbuhan  organik  (asam  amino,  asam nukleat  dan  vitamin)  diperlukan  dalam  jumlah  besar  sehingga  perlu  ada tambahan  nutrien  ke  dalam  media  dalam  bentuk  komponen  tunggal  seperti garam amonium dan potasium fosfat (Kosaric et al. di dalam Subekti 2006).
2.5. Bioetanol
Bioetanol adalah etanol yang dibuat dari  biomass yang mengandung komponen pati atau selulosa, seperti singkong dan tetes tebu. Dalam dunia industri, etanol umumnya  dipergunakan sebagai bahan baku industri turunan alkohol, campuran untuk minuman keras (seperti sake atau gin), serta bahan baku farmasi dan kosmetika. Berdasarkan kadar alkoholnya, etanol terbagi menjadi tiga 
grade sebagai berikut: 
1.	Grade industri dengan kadar alkohol 90-94% 
2.	Netral dengan kadar alkohol  96-99,5%, umumnya digunakan untuk minuman keras atau bahan baku obat dalam industri farmasi 
3.	Grade bahan bakar dengan kadar alkohol diatas 99,5% 
(Prihardana., 2008).

2.5.1. Proses Pembuatan Bioetaol
Secara  umum,  proses  pengolahan  bahan  berpati  seperti  ubi  kayu,  jagung dan sagu untuk menghasilkan bioetanol dilakukan dengan proses urutan. Pertama adalah  proses  hidrolisis,  yakni  proses  konversi  pati  menjadi  glukosa.  Pati merupakan  homopolimer  glukosa  dengan  ikatan a-glikosidik. Pati  terdiri  dari  dua fraksi yang dapat dipisahkan dengan air panas, fraksi terlarut disebut amilosa dan fraksi  tidak  terlarut disebut amilopektin. Tahap kedua adalah proses  fermentasi untuk mengkonversi glukosa  (gula) menjadi etanol dan CO2. Khamir  yang  sering  digunakan  dalam  fermentasi  alkohol  adalah Saccharomyces  cerevisiae,  karena  jenis  ini  dapat  berproduksi  tinggi,  toleran terhadap alkohol yang cukup  tinggi (12-18% v/v),  tahan  terhadap kadar gula yang tinggi dan tetap aktif melakukan fermentasi pada suhu 4-32oC.  
Setelah  proses  fermentasi  selesai,  dilakukan  destilasi  untuk  memisahkan etanol. Distilasi merupakan pemisahan komponen berdasarkan  titik didihnya. Titik didih  etanol  murni  adalah  78oC  sedangkan  air  adalah  100oC  (Kondisi  standar). Dengan memanaskan larutan pada suhu rentang 78 – 100oC akan mengakibatkan sebagian besar etanol menguap, dan melalui unit kondensasi akan bisa dihasilkan etanol dengan konsentrasi 95 % volume (Musanif, 2012).
2.5.2. Hidrolisis Pati
Proses  hidrolisis  pati  yaitu  pengubahan  molekul  pati  menjadi monomernya  atau  unit-unit  penyususnya  seperti  glukosa.  Hidrolisis  pati  dapat dilakukan dengan bantuan asam atau enzim pada suhu, pH, dan waktu reaksi tertentu. Pemotongan  rantai  pati  oleh  asam  lebih  tidak  teratur  dibandingkan  dengan  hasil pemotongan  rantai  pati  oleh  enzim.  Hasil  pemotongan  oleh  asam  adalah  campuran dekstrin, maltosa dan glukosa, sementara enzim bekerja secara spesifik sehingga hasil hidrolisis  dapat  dikendalikan  (Trifosa,  2007).
Tahap ini merupakan tahap yang paling penting dalam proses pembuatan bioetanol,  karena  proses  ini  menentukan  jumlah  glukosa  yang  dihasilkan  untuk kemudian dilakukan fermentasi menjadi bioetanol. 
Menurut Musanif (2008), prinsip hidrolisis pati adalah pemutusan rantai polimer pati menjadi    unit-unit dekstrosa atau monosakarida  yaitu glukosa (C6H12O6). Pemutusan ikatan pada pati atau karbohidrat menjadi  glukosa  dapat  menggunakan  beberapa  metode  diantaranya  yaitu  metode kimiawi (hidrolisis asam) dan metode enzimatis (hidrolisis enzim). 
Metode  kimiawi  dilakukan  dengan  cara  hidrolisis  pati  menggunakan asam-asam  organik,  yang  sering  digunakan  adalah  H2SO4,  HCl,  dan  HNO3
Hasil pemotongan  oleh  asam  adalah  campuran  dekstrin,  maltosa  dan  glukosa  (Trifosa, 2007).
Hidrolisis  asam  dapat  dipergunakan  untuk  memecah  komponen polisakarida  menjadi  monomer-monomernya. Proses  hidrolisis  yang  sempurna akan  memecah  selulosa dan  pati menjadi  glukosa,  sedangkan hemiselulosa akan  terpecah menjadi  pentosa  dan  heksosa. Asam  sulfat (H2SO4) merupakan  asam yang  dapat  digunakan  sebagai  katalis  asam  selain  asam  klorida  (HCl). Hidrolisis asam dikelompokkan menjadi dua yaitu hidrolisis asam pekat dengan konsentrasi tinggi dan hidrolisis asam encer dengan konsentrasi rendah (Taherzadeh, et.al, 2007). 
Keuntungan  hidrolisis  menggunakan  asam  konsentrasi  tinggi  antara  lain proses  hidrolisis  dapat  dilakukan  pada  suhu  yang  rendah  dan  hasil  gula yang didapatkan  tinggi.  Namun  penggunaan  asam  konsentrasi  tinggi  mempunyai kelemahan antara lain jumlah asam yang digunakan sangat banyak, potensi korosi pada  peralatan  produksi  terutama  alat  yang  terbuat  dari  besi,  penggunaan  energi yang  tinggi  untuk  proses  daur  ulang  asam  dan  waktu  reaksi  yang  lama  yaitu berkisar  antara  dua  hingga  enam  jam.  Hidrolisis  menggunakan  asam  dengan konsentrasi  rendah  mempunyai  keuntungan  antara  lain  jumlah  asam  yang digunakan  sedikit  dan  waktu  tinggal  yang  sebentar.  Namun  kerugian  dalam penggunaan asam encer dengan konsentrasi rendah antara lain membutuhkan suhu tinggi dalam proses operasinya, gula yang didapatkan sedikit, potensi korosi pada peralatan  produksi  terutama  alat  yang  terbuat  dari  besi  dan  pembentukan produk samping yang tidak diharapkan (Taherzadeh, et.al, 2007). 
Hidrolisis  asam  dengan  konsentrasi  rendah  dilakukan  dalam  dua  tahap yaitu  tahap  pertama  yang  melibatkan  asam  encer  untuk  menghidrolisis  gula  dari golongan  pentosa yang  umumnya  terdapat  dalam  fraksi  hemiselulosa.  Tahap  ini biasanya  menggunakan  H2SO4 1%  pada  suhu       80oC-120oC selama 30-240  menit. Tahap  kedua  menggunakan  asam  dengan  konsentrasi  yang  lebih  tinggi  untuk menghidrolisis  gula  yang  berasal  golongan  heksosa  seperti  selulosa  biasanya dilakukan  dengan  konsentrasi  asam  5-20%  H2SO4 dengan  suhu  180oC.  Proses hidrolisis  bertahap  ini  dapat  memaksimalkan  hasil  glukosa  yang  dihasilkan  dan meminimumkan hasil samping yang tidak diinginkan (Purwadi, 2006).
2.5.3. Fermentasi
Fermentasi dapat didefinisikan sebagai perubahan gradual oleh enzim beberapa bakteri, ragi, dan jamur. Contoh perubahan kimia dari fermentasi meliputi pengasaman susu, dekomposisi pati dan gula menjadi alkohol dan karbon 
dioksida, serta oksidasi senyawa nitrogen organik. Bahan dasar untuk kebutuhan fermentasi dapat berasal dari hasil pertanian, perkebunan, maupun limbah industri. Bahan dasar yang umum dipergunakan di negara berkembang adalah: 
1.  Molase ( karena banyaknya tebu di negara tersebut). 
2.  Pati (gandum, jagung, beras, dll.) 
3.  Jerami 
4.  Dedak 
5.  Kulit kopi, kulit coklat, sabut kelapa. 
6.  Ampas tebu, ampas biji-bijian yang telah diambil minyaknya. 
7.  Kotoran binatang 
8.  Air limbah. 
9.  Sampah sebagai komponen pupuk 
10. Sisa pabrik kertas, pabrik susu, dan sebagainya. 
Bahan dasar harus memenuhi syarat-syarat sebagai berikut: Mudah didapat, jumlahnya besar, murah harganya dan bila diperlukan ada penggantinya.          (Hidayat., dkk. 2007). 
Penggunaan inokulum murni dalam fermentasi akan memperbaiki mutu produk dan mengurangi kontaminasi. Inokulum tradisional yang umum dipakai masyarakat awam adalah sumber kontaminan karena mikroorganisme di dalamnya tidak diketahui secara pasti. Adanya mikroorganisme penghasil pigmen, 
terutama kapang akan menyebabkan produk fermentasi menjadi berwarna, berasa 
asam dan memiliki bau yang asing. Inokulum atau ragi yang ditambahkan dalam fermentasi biasanya kurang dari 1%. Umumnya jumlah ragi yang dipakai adalah 0,2 – 0,5%  (Hidayat., dkk. 2007).
2.5.4. Faktor-faktor yang mempengaruhi Fermentasi
Faktor-faktor yang mempengaruhi proses fermentasi untuk menghasilkan etanol adalah: sumber karbon, gas karbondioksida, pH substrat, nutrien, temperatur, dan oksigen. 
Ada berbagai faktor yang mempengaruhi pertumbuhan khamir yaitu : 
1.  Nutrisi 
Dalam kegiatannya, ragi memerlukan penambahan nutrisi untuk pertumbuhan dan perkembangbiakan, yaitu: Unsur C dari senyawa karbohidrat, Unsur N dan P dari senyawa protein, Mineral, Vitamin 
2.  Keasaman (pH) 
Untuk fermentasi alkohol, ragi memerlukan media dengan suasana asam yaitu antara 4,8 – 6,0. Pengaturan pH dapat dilakukan dengan penambahan asam sulfat encer bila substrat fermentasinya bersifat alkalis dan penambahan natrium bikarbonat jika substratnya terlalu asam. 

3.  Suhu 
Suhu optimum untuk fermentasi pada umumnya adalah pada suhu            25-300C. 
4.  Oksigen 
Fermentasi etanol berlangsung anaerobik, dalam kondisi tanpa oksigen tersebut ragi akan menggunakan glukosa sebagai sumber energinya dan membentuk etanol dan karbon dioksida sebagai metabolitnya. 
(Hidayat., dkk.  2007).
2.5.5 Destilasi
Destilasi merupakan teknik pemisahan yang didasari atas perbedaan perbedaan titik didih atau titik cair dari masing-masing zat penyusun dari campuran homogen. Dalam proses destilasi terdapat dua tahap proses yaitu tahap penguapan dan dilanjutkan dengan tahap pengembangan kembali uap menjadi cair atau padatan. Atas dasar ini maka perangkat peralatan destilasi menggunakan alat pemanas dan alat pendingin. 
Proses destilasi diawali dengan pemanasan, sehingga zat yang memiliki titik didih lebih rendah akan menguap. Uap tersebut bergerak menuju kondensor yaitu pendingin ,proses pendinginan terjadi karena kita mengalirkan air kedalam dinding (bagian luar kondensor), sehingga uap yang dihasilkan akan kembali cair. Proses ini berjalan terus menerus dan akhirnya kita dapat memisahkan seluruh senyawa-senyawa yang ada dalam campuran homogen tersebut (Musanif, 2012).
Untuk memperoleh bio-etanol dengan kemurnian lebih tinggi dari 99,5% atau yang umum disebut  fuel based ethanol . Masalah yang timbul adalah sulitnya memisahkan hidrogen yang terikat dalam  struktur kimia alkohol dengan cara destilasi biasa. Oleh karena itu untuk mendapatkan  fuel based ethanol  dilaksanakan pemurnian lebih lanjut dengan cara  destilasi azeotrop. Azeotrop adalah keadaan di mana suatu larutan mempunyai fasa uap dan fasa cair yang sama saat dididihkan (Nurdyastuti, 2006).